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實(shí)驗(yàn)案例
2020/12/21 12:03:21

提取組織器官RNA|凈信多樣品組織勻漿機(jī)實(shí)驗(yàn)案例

來源:上海凈信

組織樣品中RNA的提取實(shí)驗(yàn):本實(shí)驗(yàn)的組織樣品主要有小鼠的各個(gè)組織器官(如肝臟,肌肉,脂肪等)和人腫瘤標(biāo)本(如結(jié)直腸癌,肺癌,乳腺癌)

1.首先要根據(jù)需要抽提的組織樣品的質(zhì)量加入相應(yīng)的TRIZOL液體,同時(shí)加入若干顆不銹鋼柱。本實(shí)驗(yàn)室一般情況如下:(小鼠組織加入TRIZOL,結(jié)直腸癌標(biāo)本加入TRIZOL)

注意:

a.用凈信勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿處理時(shí)樣品體積不要超過TRIzol體積10℅)

b.需事先預(yù)冷試管座

2.把加入樣品,TRIZOL,不銹鋼柱的Axygene EP管放入事先預(yù)冷好的試管座中。機(jī)器設(shè)置好參數(shù)蓋上蓋子,點(diǎn)擊運(yùn)行

3.機(jī)器運(yùn)行完畢后,打開蓋子,拿出凈信EP管仔細(xì)觀察組織的研磨情況,如果沒有明顯的塊狀物,那就可以進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)步驟,如果沒有完全打碎,還需要把EP管放入試管座中,繼續(xù)勻漿。有些堅(jiān)硬,或者脂肪含量高的組織(乳腺)可能需要稍微長一點(diǎn)的時(shí)間,時(shí)間可以依據(jù)組織實(shí)際的研磨情況來調(diào)整勻漿時(shí)間。

4.和傳統(tǒng)的TRIZOL提取RNA的方法一樣,將勻漿樣品在室溫放置幾分鐘,使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

5.每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿,劇烈振蕩若干秒,室溫放置幾分鐘。

6.2-8℃10000×g離心十幾分鐘。樣品分為三層:底層為黃色有機(jī)相,上層為無色水相和一個(gè)中間層。

7.把水相轉(zhuǎn)移到新管中,如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相,進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入異丙醇,室溫放置幾分鐘。

8.2-8℃10000×g離心10分鐘,離心前看不出RNA沉淀,離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

9.用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超過7500×g離心幾分鐘,棄上清。

10.室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀,大約晾5-10分鐘即可.不要真空離心干燥,過于干燥會導(dǎo)致RNA的溶解性大大降低。加入無RNase的水,用槍頭吸打幾次,55-60℃放置10分鐘使RNA溶解.如RNA用于酶切反應(yīng),勿使用SDS溶液。

常見問題分析:

1得率低:

A.樣品裂解或勻漿處理不徹底

B.RNA沉淀未完全溶解

C.檢測吸光度時(shí),RNA樣品沒有溶于水,而溶于了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高

D.樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少

E.勻漿樣品時(shí)未在室溫放置幾分鐘

F.吸取水相時(shí)混入了有機(jī)相

2 RNA降解

A.組織取出后沒有馬上處理或冷凍

B.待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃

C.細(xì)胞在用胰酶處理時(shí)過度

D.溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理

E.電泳時(shí)使用的甲醛pH值低于了3.5

3 DNA污染:

A.樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少

B.樣品中含有有機(jī)溶劑(如乙醇,DMSO等),強(qiáng)緩沖液或堿性溶液

預(yù)防RNA污染注意事項(xiàng):

1.經(jīng)常更換新手套,皮膚上常帶有的細(xì)菌,霉菌可能成為RNase的來源。

2.使用滅過菌的RNA專用塑料制品避免交叉污染。

3.RNA在TRIzol試劑中時(shí)不會被RNase污染,但提取后繼續(xù)處理過程中應(yīng)使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。

4.配制溶液應(yīng)使用無RNase的水

本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)研磨的各個(gè)組織中發(fā)現(xiàn)肝臟組織是很容易研磨且研磨效率是很好的。

下圖A是RNA經(jīng)過傳統(tǒng)的液氮研磨和勻漿器研磨法抽出的RNA跑膠圖,結(jié)果很明顯發(fā)現(xiàn)這種方法是可行的,是可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的方法的。

下圖B是利用組織勻漿器對小鼠的各個(gè)組織進(jìn)行勻漿抽出的RNA跑膠圖。發(fā)現(xiàn)在抽提各個(gè)組織的RNA的時(shí)候也是可行的。

圖C是利用組織勻漿器對人結(jié)腸癌標(biāo)本進(jìn)行了研磨后抽提出的RNA的跑膠圖。

圖D是小鼠的肝臟組織經(jīng)過手工研磨和機(jī)器勻漿后,抽提得到的RNA進(jìn)行了濃度的測定,結(jié)果說明組織勻漿器抽提出得RNA的濃度要顯著高于傳統(tǒng)的手工的方法得到的RNA。

蛋白質(zhì)的提取

A.根據(jù)需要抽提的組織樣品的質(zhì)量加入相應(yīng)的蛋白質(zhì)裂解液(如RIPA),同時(shí)加入3顆不銹鋼柱。(小鼠肝臟組織加入1mlRIPA蛋白裂解液,人結(jié)直腸癌組織加入500ulRIPA蛋白裂解液)

B.把加入樣品,蛋白裂解液,不銹鋼柱的Axygene EP管放入事先預(yù)冷好的試管座中。機(jī)器設(shè)置好參數(shù)蓋上蓋子,點(diǎn)擊運(yùn)行。

以下同上RNA的操作方法:

所得到的蛋白質(zhì)濃度的測定經(jīng)過BCA試劑盒測定完成的,同時(shí)通過SDS-PAGE后經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)染色和western blot檢測都發(fā)現(xiàn)其要比傳統(tǒng)的方法更加簡便快捷,不容易引起交叉污染。

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